【前沿＆进展】天津医科大学张恒团队和武汉病毒研究所邓增钦团队合作解析III-E CRISPR-Cas系统的蛋白酶活性与调控机制

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近日，天津医科大学基础医学院张恒团队联合中国科学院武汉病毒所邓增钦团队在Nucleic Acids Research期刊上发表题为Target RNA-guided protease activity in type III-E CRISPR–Cas system的研究论文。

III-E 型 CRISPR-Cas系统是原核生物中新发现的适应性免疫系统，不同于典型的多亚基III型系统，它由4个Cas7和1个Cas11结构域融合形成一个大的效应蛋白Cas7-11，并在crRNA指引下对target RNA进行特异性切割。Csx29是由III-E型位点中的常见基因编码的一种半胱天冬酶样蛋白（Caspase-like protein），Cas7-11能与其相互作用，形成由CRISPR引导的Caspase复合物(Craspase)，这表明RNase与III-E型系统中蛋白酶活性之间存在着功能联系。该团队在之前的研究成果上进行了进一步的研究（前期成果发表在Nature Microbiology），通过解析Craspase复合物不同状态的冷冻电镜结构，发现Cas7-11识别target RNA后，能够引起Csx29的构象变化，从而激活其蛋白酶活性发挥免疫功能。同时通过大量体外生化实验找到Csx29的切割底物Csx30（又称YYY）并阐明了Csx29的蛋白水解活性机制。

在之前的研究中，作者通过比较Craspase被target RNA激活前后的结构，发现Csx29的两个催化残基H585和C627在空间上更加靠近，从而暴露出其催化口袋。因此，寻找Csx29的切割底物成为了研究的下一个关键问题。首先，作者通过筛选纯化多种蛋白进行体外的Craspase切割实验，发现了一个与Cas7-11和Csx29位于同一基因座的基因Csx30表达的蛋白可以被切割成两个片段。通过Edman N端降解法，作者确认了Csx30在L407位后被切割，并且详细的突变研究揭示了P1位的突变会完全消除Craspase的酶切能力以及P1位置对Leu和Met残基的偏好（图1）。不同于传统的Caspase依赖四肽识别切割底物的机制，作者通过构建N端和C端融合蛋白进行酶切实验发现Csx30的切割发生可能依赖于特定的结构识别。

图1 Craspase的蛋白底物切割活力

作者通过结构分析和突变实验发现Cas7-11切割位点失活的突变体会增加Craspase的切割效率。并且有趣的是，虽然同源target RNA（CTR）识别会激活Csx29，但具有互补的3’ anti-tag序列的非同源target RNA（NTR）却会抑制酶活性。为了解释这一现象，作者利用JEOL冷冻电镜（JEM-Z300FSC）解析了结合了NTR的Craspase高分辨率冷冻电镜结构，发现位于重复序列3′末端的前两个核苷酸与NTR互补时会阻碍Csx29发生构象变化，从而也使得Csx29不能暴露其催化口袋，进而抑制其蛋白酶活力（图2）。这一机制与典型的III-A/B型CRISPR-Cas系统类似，可能有助于III-E型系统更好地识别“自我”和“非我”RNA。

图2 Craspase复合体分别结合CTR和NTR的结构比较

最后，作者发现Csx30基因附近存在一个编码RNA转录调控蛋白RpoE的基因，通过pulldown和ITC作者发现RpoE和Csx30的NTD结构域相互作用，这暗示Craspase很可能通过切割Csx30使与RpoE结合的NTD释放，进而调控细胞的RNA转录，从而起到抵抗病毒的作用。

图3III-E型CRISPR-Cas抗病毒模式图

综上所述，这些发现阐明了Cas效应子与辅助蛋白酶Csx29之间的功能关系，并为III-E型CRISPR-Cas系统抵御病毒的机制提供了新见解。作者的研究将RNA和蛋白质联系在一起，为开发由RNA靶向的蛋白质编辑工具和利用RNA进行体外检测提供理论基础和方向。